Primary hepatocyte isolation

Primary hepatocyte isolation 과정

※미리 준비해야 할 것

PBS, Washing buffer, Collagenase, 실, 마취제(실험동물의 용적 고려..?)

1. rat에 마취제 투여(복강 내 투여)

2. 개복하고 간문맥을 찾는다.

3. Cannulate the portal vein, 실로 고정

4. Washing buffer를 흘려보내고 들어간 버퍼의 부피를 확인하며 진행

*버퍼가 잘 들어가면 간이 팽팽해진다.

5. 복대정맥 자른다.

*버퍼가 간문맥을 통해 간으로 잘 들어가는 지 알기 위해 자른 복대정맥을 잡고 잠시 후 풀어 보면 버퍼가 슉 나온다.

6. 버퍼가 모두 들어가면 Collagenase를 주입한다.

*간을 잘 보면 Collagenase가 들어가면 간 표면이 점점점점이 생긴다. Collagenase를 계속 넣으면 겉이 바스러진다고.

*Collagenase의 역할은 세포간 결합을 분해시켜 세포를 분리할 수 있게한다.

7. 간을 분리한다. 간엽들을 고정하는 흰 줄을 잘 제거하여 페트리 디쉬로.

8. 페트리 디쉬에 담긴 간은 클린벤치로 이동한다.

9. 간에 배지를 붓고 핀셋으로 간을 쪼물쪼물 하면 hepatocyte등 여러 세포들이 배지로 흘러나온다.

10. 색깔이 탁한 황토색으로 변하고 간이 아주 조그마해질 때까지 쪼물쪼물

배지+간세포를 걸러준다. (붕대같은 거..면포?같은 걸로 걸러준다)

*mouse의 경우에는 전용 체가 있는데, Rat은 너무 오래 걸리기 때문에 이렇게 한다고 한다.

11. Conical tube에 담아서 centrifuge 50 RCF(G force), 2 min.

12. 상층액-stellate cell

*Stellate cell은 매우 가볍다고 한다. 상층액은 따서 잠시 4도에 보관(냉장실)

하층액은 배지 넣고 다시 50 RCF, 2min. - Washing

Hepatocyte는 이렇게 얻어서 콜라겐이 코팅된 플레이트(Collagen-coated plates)에 깔아준다.

13. 이제 HSC를 분리

냉장고에 넣어둔 stellate cell이 있는 상층액 꺼내서 ficoll,percoll 9:1로 넣어주고

가장 상층에 PBS를 얹어준다.

*gradient를 걸어준다고 함

14. 1400g, 15 min.

15. PBS층에 세포뭉탱이가 보이는데 이를 취한다.

16. 취한 후 배지를 가득 채워서 원심분리. 1400g, 5min

17. 원심분리 하면 펠렛이 생기는데 펠렛만 얻어서 배지(Stellate cell의 배지는 우리가 일반적으로 사용하는 배지에, 1.5배의 p/s) 가해서 잘 풀어주고 깔아주면 끝

★새로 알게 된 사실.

primary hepatocyte는 subculture가 불가하지만, HSC는 가능하다

Stellate cell은 평소에는 작은 원모양이지만 자극을 받으면 쫙쫙 펴진다. 이 것을 활성화되었다고 하는데, Stellate cell의 활성화 marker는 α-SMA(Alpha-Smooth Muscle Actin).

간을 이루고 있는 세포는 Hepatocyte가 80%, stellate cell은 10%가 채 안된다고.

 

계대배양도 할 수 없는 Hepatocyte를 이렇게 힘들게 분리해 내는 이유

우리가 평소에 (Hepatocyte보다는 편하게)간편하게 단백질이나 DNA, RNA등의 발현을 보는 HepG2는 Hepatocyte에서 만들어졌다고 해도 세포 고유의 기능이나 발현 양상이 달라질 수 있다. 따라서 HepG2에서 보여지는 결과와 primary hepatocyte에서 보여지는 결과를 비교,대조하여 결과적으로 그렇다!라고 할 수 있는 신뢰성을 확보할 수 있다!!

 

PS. 열심히 실험을 해서 조건 잡아 간세포에도 실험을 하는 날이 오길!